Анализы

Иммунофенотипирование лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, NK и др.)

Идентификация и биохимия

Полное название анализа: Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови с определением экспрессии CD3, CD4, CD8, NK-клеточных маркеров (например, CD16, CD56) и других поверхностных антигенов.

Синонимы: Проточная цитометрия лимфоцитов, фенотипирование Т- и В-лимфоцитов, количественный анализ субпопуляций лимфоцитов, иммунофенотипирование лейкоцитов.

Маркеры: CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD56, CD16, CD45, CD34 и др. — это кластеры дифференцировки (cluster of differentiation), представляющие собой молекулы на поверхности клеток, используемые для идентификации клеточных популяций.

Биохимическая природа: Молекулы CD-серии являются трансмембранными гликопротеинами или гликолипидами, участвующими в адгезии, распознавании и сигнализации между клетками. Их экспрессия специфична для определённых стадий дифференцировки и типов клеток.

  • CD3 — часть Т-клеточного рецепторного комплекса; молекулярная масса около 20 кДа; экспрессируется на всех зрелых Т-лимфоцитах.
  • CD4 — гликопротеин, молекулярная масса ~55 кДа; рецептор для MHC-II; маркер Т-хелперов.
  • CD8 — димерный гликопротеин, масса ~80–85 кДа; связывается с MHC-I; маркер цитотоксических Т-лимфоцитов.
  • CD16 (FcγRIII) и CD56 — маркеры естественных киллеров (NK-клеток); CD56 — нейрональная адгезия молекула (NCAM), масса 140–220 кДа.

Гены: Каждый маркер кодируется отдельным геном:

  • CD3 — CD3D, CD3E, CD3G (хромосомы 11 и 7)
  • CD4 — CD4 (хромосома 12)
  • CD8A и CD8B (хромосома 2)
  • CD56 — NCAM1 (хромосома 11)

LOINC-коды: LOINC-коды варьируются в зависимости от лаборатории, платформы и набора маркеров. Например, для CD4+ T-лимфоцитов может использоваться LOINC 10899-0 (CD4+ T-lymphocytes [#/Volume] in Blood), но полный панельный анализ не имеет единого стандартизированного LOINC-кода. Точный код следует уточнять в конкретной лаборатории.

SNOMED CT: Также зависит от конкретного маркера и методики. Например, Flow cytometry for lymphocyte subsets (procedure) имеет код 252285003. Полная стандартизация отсутствует.

Физиологическая роль

Иммунофенотипирование позволяет количественно и качественно оценить субпопуляции лимфоцитов, которые играют ключевую роль в адаптивном и врождённом иммунитете.

Место образования: Лимфоциты происходят из гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Т-клетки созревают в тимусе, В-клетки — в костном мозге, NK-клетки — в костном мозге и лимфоидных тканях.

Функции субпопуляций:

  • CD3+ Т-лимфоциты: Центральные исполнители клеточного иммунитета. Участвуют в распознавании чужеродных антигенов через Т-клеточный рецептор (TCR), связанный с CD3.
  • CD4+ Т-хелперы: Координируют иммунный ответ: активируют В-клетки, макрофаги, цитотоксические Т-клетки через цитокины (IL-2, IFN-γ, IL-4 и др.). Участвуют в дифференцировке Th1, Th2, Th17, Treg.
  • CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты: Уничтожают инфицированные и опухолевые клетки через перфорин/гранзимы и Fas/FasL-путь.
  • NK-клетки (CD16+/CD56+): Часть врождённого иммунитета. Распознают и лизируют клетки с пониженной экспрессией MHC-I («отсутствие self»), не требуя предварительной с致ензитизации.
  • CD19+/CD20+ В-лимфоциты: Участвуют в гуморальном иммунитете: продуцируют антитела, представляют антигены.

Ключевые сигнальные пути:

  • TCR-CD3-сигнализация: активация каскада киназ (Lck, ZAP-70), приводит к пролиферации и дифференцировке Т-клеток.
  • CD28/B7-взаимодействие: костимуляция Т-клеток.
  • NK-рецепторы: активирующие (NKG2D, CD16) и ингибиторные (KIR) рецепторы регулируют цитотоксичность.

Патофизиология

Изменения в соотношении и абсолютных числах субпопуляций лимфоцитов отражают нарушения иммунной системы.

Снижение CD4+ Т-лимфоцитов:

  • ВИЧ-инфекция: Вирус поражает CD4+ Т-клетки через рецептор CCR5/CXCR4, приводя к прогрессивному истощению пула. Снижение CD4 ниже 200 кл/мкл — критерий СПИДа.
  • Вторичные иммунодефициты: при хронических инфекциях, онкологии, длительной иммуносупрессии (например, после трансплантации).
  • Первичные иммунодефициты: например, синдром Ди Джорджи (дефицит Т-клеток из-за аплазии тимуса).

Повышение CD4+:

  • Аутоиммунные заболевания (например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит) — избыточная активация Т-хелперов.
  • Хронические воспалительные процессы.

Снижение CD8+:

  • ВИЧ на поздних стадиях, тяжёлые вирусные инфекции (цитомегаловирус, EBV), иммуносупрессия.

Повышение CD8+:

  • Острые вирусные инфекции (например, мононуклеоз), реакция «трансплантат против хозяина» (ГВГ), некоторые лимфомы.

Изменения NK-клеток:

  • Снижение — при некоторых иммунодефицитах, хронических вирусных инфекциях, опухолях.
  • Повышение — при вирусных инфекциях, аутоиммунных процессах.

Нарушение соотношения CD4/CD8:

  • Норма: 0,8–2,0. Обратное соотношение (<1,0) наблюдается при ВИЧ, хроническом активации иммунной системы, старении (иммунный сенисканс).

Референсные значения

Референсные значения зависят от лаборатории, метода, возраста и популяции. Приведены ориентировочные данные для взрослых, полученные методом проточной цитометрии.

Показатель Референсный интервал (взрослые) Единицы измерения Примечания
CD3+ (Т-лимфоциты) 60–80% % от лимфоцитов Абсолютные значения: 800–3000 кл/мкл
CD4+ (Т-хелперы) 30–50% % от лимфоцитов Абсолютные: 500–1500 кл/мкл
CD8+ (цитотоксические Т) 15–30% % от лимфоцитов Абсолютные: 200–1000 кл/мкл
CD4/CD8 отношение 0,8–2,0 отношение Повышено при аутоиммунных, снижено при ВИЧ
NK-клетки (CD16+/CD56+) 5–20% % от лимфоцитов Абсолютные: 100–700 кл/мкл
CD19+/CD20+ (В-лимфоциты) 5–15% % от лимфоцитов Абсолютные: 100–500 кл/мкл

Примечание: У детей референсные значения существенно отличаются: у новорождённых ниже CD4 и CD8, к 2–5 годам достигают взрослых уровней. Пол не оказывает существенного влияния.

Методы определения

Основной метод — проточная цитометрия (flow cytometry).

Принцип: Клетки из периферической крови мечены флуоресцентными моноклональными антителами к CD-антигенам. При прохождении через лазерный луч измеряется рассеяние света и флуоресценция, что позволяет идентифицировать и количественно оценивать субпопуляции.

Платформы:

  • Becton Dickinson (BD FACSCalibur, BD LSRFortessa)
  • Beckman Coulter (Navios, DxFLEX)
  • Agilent (NovoCyte)

Чувствительность: Проточная цитометрия позволяет детектировать популяции, составляющие менее 1% от общего числа лимфоцитов. Предел обнаружения — около 10–50 кл/мкл при правильной подготовке образца.

Преаналитические требования:

  • Кровь — в пробирках с ЭДТА (фиолетовая крышка), гепарином (зелёная) или цитратом.
  • Транспортировка: при температуре 4–25 °C, анализ — в течение 24–48 часов (зависит от лаборатории).
  • Не допускается замораживание цельной крови.
  • Объём образца: минимум 1–2 мл.

Другие методы (ИФА, ПЦР) не используются для фенотипирования субпопуляций. ИФА применяется для определения цитокинов, ПЦР — для выявления мутаций или вирусной нагрузки, но не для подсчёта клеток.

Клинические показания

Показано назначать при:

  1. Подозрении на первичные или вторичные иммунодефициты (частые, тяжёлые, атипичные инфекции).
  2. Диагностике и мониторинге ВИЧ-инфекции (определение стадии, времени начала АРВТ).
  3. Оценке иммунного статуса у пациентов на иммуносупрессивной терапии (например, при ревматоидном артрите, после трансплантации).
  4. Подозрении на лимфопролиферативные заболевания (лимфомы, лейкозы).
  5. Диагностике аутоиммунных заболеваний с иммунной дисрегуляцией.
  6. Оценке эффекта иммунотерапии (например, при онкологии — терапии checkpoint inhibitors).

Не показано рутинно:

  • При общем диспансерном обследовании.
  • Для скрининга инфекций (например, ОРВИ).
  • При неосложнённых аллергических заболеваниях.
  • Без клинических показаний (например, «проверить иммунитет»).

Интерференции и ограничения

Лекарственные воздействия:

  • Кортикостероиды — вызывают лимфопению, особенно снижают CD4+ и CD8+.
  • Цитостатики (циклофосфамид, метотрексат) — подавляют пролиферацию лимфоцитов.
  • Моно- или поликлональные антитела (ритуксимаб, алемтузумаб) — вызывают целенаправленную деплетицию (например, ритуксимаб — В-клетки, алемтузумаб — Т- и В-клетки).
  • Иммунодепрессанты (такролимус, циклоспорин) — подавляют активацию Т-клеток, но не всегда снижают абсолютные числа.

Биологические факторы:

  • Циркадные ритмы: Уровень лимфоцитов выше утром, ниже вечером.
  • Физическая нагрузка: Острая — может временно повышать NK-клетки.
  • Стресс: Активация симпатической нервной системы — лимфопения.
  • Гемодилюция: При беременности или переливании жидкостей — ложное снижение концентрации.

Ограничения метода:

  • Не оценивает функциональную активность клеток (только количественно и по фенотипу).
  • Не выявляет активированные или анергичные субпопуляции без дополнительных маркеров (например, CD25, HLA-DR, CD69).
  • Результаты зависят от качества антител, калибровки прибора, опыта оператора.

Интерпретация и тактика

Интерпретация требует сопоставления с клинической картиной, анамнезом и другими лабораторными данными.

При снижении CD4+:

  • При подозрении на ВИЧ — срочно провести тест на ВИЧ, вирусную нагрузку.
  • При значениях <200 кл/мкл — риск оппортунистических инфекций; показана профилактика (например, ко-тримоксазол при CD4<200).
  • При иммуносупрессии — оценить необходимость коррекции терапии.

При повышении CD8+ или снижении CD4/CD8:

  • Оценить на фоне хронических инфекций (CMV, EBV, гепатиты), аутоиммунных заболеваний, старения.
  • При ВИЧ — мониторинг эффективности АРВТ (цель — восстановление CD4 >500 кл/мкл и нормализация CD4/CD8).

При отклонениях у пациентов на иммуносупрессии:

  • Оценить риск инфекций и рецидивов заболевания.
  • При выраженной лимфопении — рассмотреть снижение дозы или замену препарата.

Советы пациенту:

  • Не интерпретируйте результаты изолированно — только с врачом.
  • Сообщите о всех принимаемых препаратах, включая иммуномодуляторы и биодобавки.
  • При ВИЧ: соблюдение АРВТ — ключ к восстановлению иммунитета.
  • При иммуносупрессии: избегайте контактов с инфекционными больными, вакцинируйтесь (кроме живых вакцин).

Связь с другими маркерами

Иммунофенотипирование интерпретируется в комплексе с другими лабораторными и клиническими данными:

  • Общий анализ крови с лейкоформулой: общее количество лимфоцитов, нейтрофилов — для контекста.
  • ВИЧ-тест, вирусная нагрузка (РНК ВИЧ): при снижении CD4+.
  • Иммуноглобулины (IgG, IgA, IgM): для оценки гуморального иммунитета при подозрении на иммунодефицит.
  • Цитокины (IL-2, IFN-γ, IL-6): при исследовании функциональной активности.
  • HLA-типирование: при аутоиммунных заболеваниях.
  • Молекулярные маркеры (например, TCR-репертуар, клономность): при подозрении на лимфопролиферативные заболевания.

Вывод

Иммунофенотипирование лимфоцитов — ключевой метод оценки клеточного иммунитета, позволяющий количественно определить субпопуляции Т-, В- и NK-клеток. Основано на проточной цитометрии с использованием антител к CD-маркерам. Наиболее значимо при ВИЧ, иммунодефицитах, аутоиммунных и онкологических заболеваниях. Референсные значения зависят от возраста и метода. Интерпретация требует учёта клинической картины, медикаментозного фона и других лабораторных данных. Метод не оценивает функцию клеток, но является незаменимым инструментом диагностики и мониторинга иммунных нарушений.