Анализы

Анализы и методы для оценки повреждения ДНК

Идентификация и биохимия

Анализы для оценки повреждения ДНК не представляют собой единый лабораторный тест, а включают группу методов, направленных на выявление различных форм повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включая одно- и двухцепочечные разрывы, окислительные модификации оснований, перекрестные связи и алкилирование. Эти анализы измеряют либо сами повреждённые молекулы ДНК, либо специфические белки, участвующие в репарации ДНК, которые могут служить косвенными маркерами её повреждения.

Наиболее часто используемые маркеры повреждения ДНК:

  • 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин (8-OHdG) — окисленная форма нуклеозида, образующаяся при окислительном повреждении гуанина. Синонимы: 8-oxo-2′-deoxyguanosine (8-oxodG). Не имеет единого гена, так как является продуктом модификации. Молекулярная масса — 287,2 г/моль. Обнаруживается в моче, плазме, лейкоцитах и тканях.
  • γ-Н-2АХ (гамма-фосфорилированный гистон H2AX) — модифицированная форма гистона H2AX, фосфорилируется в ответ на двухцепочечные разрывы ДНК. Ген: H2AFX. Молекулярная масса — около 15 кДа. Форма — белок, определяемый в клетках периферической крови или тканях методами иммунохимии.
  • Олигонуклеотиды, связанные с PARP1 — фермент поли(АДФ-рибоза)полимераза-1 активируется при повреждении ДНК и участвует в репарации. Ген: PARP1. Молекулярная масса — 113 кДа. Косвенный маркер.

LOINC-коды и SNOMED CT-идентификаторы варьируются в зависимости от конкретного маркера и метода определения. Например, для 8-OHdG в моче LOINC-код может быть 50105-6 (8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин [Масса/объём] в моче), но точный код зависит от лаборатории и единиц измерения. SNOMED-коды также не стандартизированы на международном уровне для всех форм повреждения ДНК. Указание кодов должно производиться индивидуально лабораторией.

Физиологическая роль

Повреждение ДНК — постоянное физиологическое явление, возникающее в результате эндогенных и экзогенных воздействий. Клетки обладают сложной системой репарации ДНК, включающей:

  • Базовую эксцизионную репарацию (BER) — устраняет модифицированные основания, например, 8-OHdG.
  • Нуклеотидную эксцизионную репарацию (NER) — удаляет крупные повреждения, такие как димеры тимина.
  • Репарацию двухцепочечных разрывов — через механизмы негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR).

γ-H2AX образуется в области двухцепочечных разрывов в течение нескольких минут после повреждения и служит сигналом тревоги для привлечения репарационных белков, таких как ATM, ATR, MDC1, 53BP1. Этот процесс регулируется киназами семейства PI3K-подобных киназ (PIKK). PARP1 активируется при одноцепочечных разрывах и катализирует присоединение АДФ-рибозы к белкам, что способствует рекрутированию факторов репарации.

Система репарации функционирует во всех клетках, особенно активна в быстро делящихся тканях: костном мозге, эпителии, иммунных клетках.

Патофизиология

Повышенный уровень повреждения ДНК наблюдается при следующих состояниях:

  • Хронический окислительный стресс — при сахарном диабете, ожирении, атеросклерозе, хронических воспалительных заболеваниях (например, ревматоидный артрит). Приводит к накоплению 8-OHdG.
  • Экспозиция токсичным агентам — курение, алкоголь, ионизирующее излучение, химиотерапевтические препараты (например, блеомицин, цисплатин), промышленные канцерогены (бензопирен, асбест).
  • Наследственные синдромы дефекта репарации ДНК — атаксия-телеангиэктазия (ATM-дефицит), синдром Ли-Фраумени (TP53-мутации), синдром Фанкони (дефекты репарации перекрёстных связей), ксеродерма пигментоза (дефект NER).
  • Онкологические заболевания — повышенная базовая частота повреждений ДНК и/или снижение эффективности репарации способствуют геномной нестабильности и канцерогенезу.
  • Старение — с возрастом эффективность репарации снижается, что сопровождается накоплением повреждённой ДНК.

Снижение уровня маркеров повреждения ДНК может наблюдаться при эффективной антиоксидантной терапии или после устранения воздействия повреждающих факторов. Однако искусственно низкие уровни γ-H2AX могут также указывать на дефекты в сигнальных путях (например, мутации ATM), что снижает способность клетки реагировать на повреждения.

Референсные значения

Маркер Биоматериал Референсные значения Единицы измерения Зависимость от метода/возраста/пола
8-OHdG Моча 0.5 – 4.0 нг/мг креатинина Зависит от метода (ИФА, ВЭЖХ-МС). Повышается с возрастом, у курильщиков. Пол не имеет существенного влияния.
8-OHdG Плазма 0.8 – 3.5 нг/мл Высокая вариабельность. Уровень зависит от диеты, окислительного стресса, преаналитической обработки.
γ-H2AX Периферические мононуклеарные клетки (PBMC) < 0.5% ядер с фокусами % клеток с иммунопозитивностью Зависит от метода (проточная цитометрия, иммунофлуоресценция). Повышается после радиации, химиотерапии. Возрастная корреляция — умеренная.
PARP1-активность Лимфоциты 10 – 50 единицы активности/мг белка Определяется функциональными тестами. Методы не стандартизированы. Нормы зависят от лаборатории.

Примечание: референсные значения сильно зависят от метода определения и популяционных особенностей. Единого стандарта пока не существует. Лаборатории должны указывать собственные референсы.

Методы определения

Для оценки повреждения ДНК используются различные методы, отличающиеся чувствительностью, специфичностью и требованиями к биоматериалу.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Применяется для количественного определения 8-OHdG в моче и плазме. Платформы: коммерческие наборы (например, Cell Biolabs, Abcam). Чувствительность — до 0.1 нг/мл. Преаналитические требования: мочу собирать в течение 24 часов или использовать разовую порцию с коррекцией на креатинин; образцы хранить при -80 °C. Возможна перекрёстная реактивность с другими окисленными нуклеозидами.

Иммуногистохимия (ИХГ) и иммунофлуоресценция

Используются для визуализации γ-H2AX в ядрах клеток. Метод позволяет выявлять фокусы повреждений. Применяется в исследованиях и в онкологии для оценки ответа на терапию. Требует свежих или замороженных образцов клеток крови или биоптатов. Качество зависит от фиксации и антител.

Проточная цитометрия

Позволяет количественно оценить % клеток с повышенным содержанием γ-H2AX. Высокая чувствительность, подходит для скрининга. Требует свежей крови, обработки в течение 2–4 часов после забора.

ВЭЖХ с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС)

Золотой стандарт для определения 8-OHdG. Обладает высокой специфичностью и чувствительностью (до 0.01 нг/мл). Требует сложного оборудования и подготовки образцов. Минимизирует ложноположительные результаты, возникающие при ИФА.

Комет-ассай (метод гель-электрофореза одиночных клеток)

Прямой метод оценки повреждений ДНК в индивидуальных клетках. Позволяет визуализировать одно- и двухцепочечные разрывы. Применяется в токсикологии и исследованиях. Требует свежих клеток, чувствителен к условиям лизиса и электрофореза.

ПЦР-базированные методы

Количественная ПЦР (qPCR) может оценивать повреждение ДНК по снижению амплифицируемости длинных фрагментов ДНК. Также используются методы, основанные на амплификации повреждённых последовательностей с использованием специфичных ферментов (например, OGG1 для 8-OHdG).

Клинические показания

Показания к назначению:

  • Оценка окислительного стресса у пациентов с метаболическим синдромом, диабетом 2 типа, атеросклерозом.
  • Мониторинг токсичности химиотерапии (особенно алкилирующих агентов и ингибиторов топоизомераз).
  • Диагностика наследственных синдромов дефекта репарации ДНК (в сочетании с генетическим тестированием).
  • Исследование воздействия профессиональных и экологических факторов (радиация, химические канцерогены).
  • Оценка эффективности антиоксидантной терапии (например, N-ацетилцистеин, витамин Е).
  • Биомаркер старения и превентивной медицины.

Когда не назначают:

  • Рутинный скрининг здоровых лиц без факторов риска.
  • Диагностика острых инфекций или воспалений без признаков хронического окислительного стресса.
  • Оценка состояния печени, почек или других органов без подозрения на генотоксичность.
  • В качестве единственного маркера для диагностики рака (низкая специфичность).

Интерференции и ограничения

  • Преаналитические факторы: задержка обработки образцов, неправильное хранение (особенно при определении 8-OHdG) могут привести к артефактному окислению ДНК in vitro.
  • Диета: употребление продуктов, богатых антиоксидантами (ягоды, зелёный чай), или, наоборот, жареной пищи, может влиять на уровень 8-OHdG.
  • Лекарства: химиопрепараты, лучевая терапия, НПВП, парацетамол могут повышать маркеры. Антиоксиданты (витамин С, Е) — снижать.
  • Физическая активность: интенсивные физические нагрузки временно повышают окислительный стресс и маркеры повреждения ДНК.
  • Биологическая вариабельность: суточные колебания, индивидуальные особенности метаболизма.
  • Ограничения методов: ИФА может давать ложноположительные результаты из-за перекрёстной реактивности; комет-ассай требует высокой квалификации исполнителя.

Интерпретация и тактика

Повышенные уровни маркеров повреждения ДНК требуют контекстуальной интерпретации:

  • При отсутствии клинических проявлений — оценка факторов риска (курение, диета, профессиональная экспозиция).
  • При химиотерапии — повышение γ-H2AX или 8-OHdG может отражать ожидаемый эффект терапии, но чрезмерное повреждение требует коррекции дозы.
  • При подозрении на наследственный синдром — направление на генетическое консультирование и тестирование (например, ATM, BRCA1/2, FANC гены).

Целевые значения при терапии:

  • При антиоксидантной терапии — снижение 8-OHdG в моче на 20–30% от исходного уровня может считаться положительным ответом.
  • После прекращения воздействия токсиканта — нормализация маркеров в течение нескольких недель.

Советы пациенту:

  • Избегать курения и чрезмерного употребления алкоголя.
  • Соблюдать сбалансированную диету с достаточным содержанием антиоксидантов (овощи, фрукты, орехи).
  • Избегать длительного пребывания на солнце без защиты.
  • Сообщать врачу о всех принимаемых добавках и лекарствах.
  • Сдавать анализы в одной и той же лаборатории для сравнения динамики.

Связь с другими маркерами

Анализы повреждения ДНК интерпретируются в комплексе с:

  • Маркерами окислительного стресса: малоновый диальдегид (МДА), активность супероксиддисмутазы (SOD), уровень восстановленного глутатиона.
  • Воспалительными маркерами: С-реактивный белок (СРБ), интерлейкин-6 (IL-6), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α).
  • Маркерами старения и метаболизма: теломерная длина, метилирование ДНК (эпигенетические часы), HbA1c.
  • Онкомаркерами: при подозрении на рак — в сочетании с PSA, CA-125, CEA и др., но не как замена.
  • Генетическими тестами: при подозрении на наследственные синдромы — секвенирование генов репарации (ATM, BRCA1/2, TP53 и др.).

Вывод

Анализы для оценки повреждения ДНК — это группа методов, позволяющих оценить геномную стабильность, уровень окислительного стресса и эффективность репарационных систем. Наиболее изученные маркеры — 8-OHdG и γ-H2AX — отражают разные типы повреждений и определяются разными методами. Референсные значения зависят от метода и лаборатории. Повышенные уровни наблюдаются при хронических заболеваниях, токсических воздействиях, старении и наследственных синдромах. Интерпретация требует учёта клинического контекста, сопутствующих маркеров и преаналитических факторов. Эти анализы полезны для мониторинга терапии, оценки рисков и диагностики редких заболеваний, но не предназначены для рутинного скрининга.